中华消化杂志,,41(3)韩涛涛,陈楚岩,王静,等.
摘要
目的研究瑞巴派特在NSAID相关小肠黏膜损伤中的保护作用及其相关机制。
方法选取21只C57BL/6小鼠，采用随机数字表法将其分为阴性对照组(0.9%氯化钠溶液连续灌胃4d)、吲哚美辛建模组(20mg/kg吲哚美辛连续灌胃4d)和瑞巴派特干预组(20mg/kg吲哚美辛灌胃4h后，给予mg·kg-1·d-1瑞巴派特灌胃，连续4d)，每组7只。建模结束后，通过大体观察和病理学分析吲哚美辛建模组和瑞巴派特干预组小鼠小肠黏膜损伤情况，采用ELISA法检测小鼠血清IL-6、IL-10、三叶因子3、前列腺素E2和EGF的含量，采用实时荧光定量PCR技术检测小鼠小肠组织中IL-6、IL-10、三叶因子3、环氧合酶2和EGF的mRNA表达水平，采用蛋白质印迹法分析小鼠小肠组织中三叶因子3、环氧合酶2和EGF蛋白质相对表达量。采用Levent检验和独立样本t检验进行统计学分析。
结果瑞巴派特干预组小鼠的小肠黏膜损伤大体评分和组织学评分均低于吲哚美辛建模组[(2.80±0.45)分比(4.60±1.14)分、(1.67±0.52)分比(3.00±0.71)分]，差异均有统计学意义(t＝2.、3.，P＝0.、0.)。吲哚美辛建模组小鼠血清IL-6的含量和小肠组织中IL-6的mRNA表达水平均高于阴性对照组，而血清IL-10的含量低于阴性对照组[(48.83±5.40)ng/L比(40.96±5.92)ng/L、5.23±2.36比1.12±0.56、(.50±10.57)ng/L比(.30±7.77)ng/L]，差异均有统计学意义(t＝2.、3.、3.，P＝0.、0.、0.)；瑞巴派特组小鼠小肠组织中IL-6的mRNA表达水平低于吲哚美辛建模组(1.74±0.82比5.23±2.36)，IL-10的mRNA表达水平高于吲哚美辛建模组(6.44±3.46比1.22±0.83)，差异均有统计学意义(t＝3.、3.，P＝0.、0.)。吲哚美辛建模组小鼠血清三叶因子3、前列腺素E2和EGF的含量，小肠组织中三叶因子3的mRNA表达水平，小肠组织中环氧合酶2和EGF的蛋白质相对表达量均低于阴性对照组[(.20±16.37)ng/L比(.30±9.66)ng/L、(32.68±6.88)ng/L比(41.51±3.20)ng/L、(.70±17.17)ng/L比(.20±10.10)ng/L、0.43±0.22比1.20±0.50、0.33±0.25比1.30±0.43、0.28±0.19比1.15±0.10]，差异均有统计学意义(t＝2.、2.、2.、3.、3.、7.，P＝0.、0.、0.、0.、0.、0.)；瑞巴派特干预组小鼠血清中前列腺素E2、EGF的含量，小肠组织中三叶因子3、环氧合酶2和EGF的mRNA表达水平，小肠组织中三叶因子3和EGF蛋白质相对表达量均高于吲哚美辛建模组[(43.55±5.28)ng/L比(32.68±6.88)ng/L、(.30±15.66)ng/L比(.70±17.17)ng/L、2.48±1.70比0.43±0.22、2.95±1.56比0.88±0.45、3.97±2.54比0.98±0.76，1.47±0.26比0.72±0.35、1.08±0.36比0.28±0.19]，差异均有统计学意义(t＝2.、3.、2.、2.、2.、3.、3.，P＝0.、0.、0.、0.、0.、0.、0.)。
结论瑞巴派特通过抑制炎症因子表达，促进肠黏膜保护因子表达，进而缓解吲哚美辛所致的小肠黏膜损伤，提示瑞巴派特在NSAID相关小肠损伤中可能通过维持肠黏膜的化学屏障从而发挥黏膜保护作用。
NSAID具有抗炎、抗风湿、解热、镇痛效应，被广泛应用于类风湿关节炎、炎症性疾病、心血管疾病和肿瘤等疾病的临床治疗。NSAID药物使用约占全球处方药物的12.1%，并呈逐渐增高趋势[]。尽管NSAID在临床发挥重要作用，但是其药物不良反应发生率居高不下。NSAID使用者的胃肠道不良反应发生率为对照组的4.7倍，限制了NSAID在临床的广泛应用[]。因此，如何有效缓解NSAID药物相关的不良反应是临床亟待解决的问题。
近年来，研究表明NSAID不仅导致胃黏膜损伤，同时也累及小肠和结肠部位，可能导致小肠炎症、溃疡、穿孔等。NSAID导致小肠黏膜损伤的具体机制仍未明确。目前认为，NSAID相关小肠黏膜损伤的机制主要为长期服用NSAID诱导环氧合酶活性下降，进而抑制前列腺素合成，引起小肠黏膜损伤[]。也有研究指出，NSAID诱发肠黏膜通透性增加，使得肠黏膜屏障功能受损[]。目前，针对NSAID相关小肠黏膜损伤尚无切实有效的特异性防治药物，因此，阐明NSAID相关肠病的发病机制，对于寻求有效的防御策略至关重要。
瑞巴派特(rebamipide)是一类内源性黏膜保护剂，主要应用于消化性溃疡、慢性胃炎和十二指肠溃疡等胃黏膜病变[]。研究显示，瑞巴派特能够诱导环氧合酶2活性并刺激前列腺素受体表达，进而提高内源性前列腺素、增加胃黏液分泌]。此外，也有报道发现瑞巴派特激活生长因子(如EGF、血管内皮生长因子和肝细胞生长因子等)表达，抑制炎症相关介质分泌，有清除活性氧自由基、促进黏膜损伤愈合等功能[]。近年来，学者们逐渐发现瑞巴派特对于NSAID相关性小肠黏膜损伤具有一定的防治作用，如一项基于胶囊内镜的多中心研究显示瑞巴派特干预能够缓解NSAID相关小肠损伤[]，但其具体机制尚未明确。本研究通过动物模型研究瑞巴派特在NSAID相关小肠黏膜损伤防治中的具体作用机制，旨在为NSAID小肠黏膜损伤临床防治提供理论依据。
材料与方法
一、实验动物与主要材料1．实验动物：6～8周龄、无特定病原动物级、雄性C57BL/6小鼠[动物生产许可证号为SYXK(京)-0]，体重为(21.57±0.63)g，购自北京维通利华有限公司。本研究通过中国医医院实验动物伦理审查委员会审核批准(XHDW-2-)。
2．实验材料：吲哚美辛购自美国Sigma公司，瑞巴派特购自浙江远力健药业有限责任公司(批号为)，ELISA试剂盒购自上海茁彩生物科技有限公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，SYBRGreen实时荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司，放射免疫分析(radioimmunoprecipitationassay，RIPA)裂解液购自上海碧云天生物技术公司，二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)试剂盒购自美国Thermo公司，三叶因子抗体(货号为sc-)、环氧合酶2抗体(货号为sc-)和EGF抗体(货号为sc-)均购自美国Cruz公司，β肌动蛋白抗体(货号为)购自美国CST公司。
二、研究方法1．NSAID慢性小肠损伤模型构建：根据文献[10]，选取0.5%羧甲基纤维素钠作为溶剂，配制20mg/kg吲哚美辛混悬液，对小鼠进行灌胃处理，连续灌胃4d后处死小鼠，观察小鼠小肠损伤情况。
2．小鼠分组和处理：共选取21只小鼠，按照体重大小进行编号，采用随机数字表法将小鼠随机分为阴性对照组、吲哚美辛建模组和瑞巴派特干预组，每组7只。根据文献[10]，所有小鼠均适应性饲养1周后，阴性对照组和吲哚美辛建模组分别给予0.9%氯化钠溶液和20mg/kg吲哚美辛灌胃，连续4d；瑞巴派特干预组在给予20mg/kg吲哚美辛灌胃4h后，再给予mg·kg-1·d-1瑞巴派特灌胃[]，连续4d。于建模前和建模第3天分别测量吲哚美辛建模组和瑞巴派特干预组小鼠体重，并将2组小鼠建模后的体重与建模前和阴性对照组小鼠进行比较。建模结束后，收集心脏血液，离心获得血清用于ELISA实验；异戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，消毒，剖开腹壁，游离小鼠肠管组织。距离回盲瓣2cm处剪开小鼠小肠肠腔，观察肠粘连情况和小肠大体损伤程度。将小肠置于预冷的0.9%氯化钠溶液中冲洗干净，随后均分为3份，分别用于H-E染色、组织RNA和总蛋白提取。
3．小鼠小肠黏膜损伤程度评估：采用Chiu氏6级评分方法对小鼠小肠黏膜损伤情况进行大体评分，即小肠黏膜损伤评分为溃疡和肠粘连的评分之和[]。取4%多聚甲醛固定的小鼠小肠组织，石蜡包埋并切片，进行H-E染色。根据H-E染色结果，对小鼠小肠黏膜损伤程度进行组织学评分。
4．ELISA实验：在小鼠处死当日进行心脏采血，以(～)×g离心10min，获得血清，静置于-80℃冰箱中保存、备用。根据ELISA试剂盒说明书，检测血清中炎症因子IL-6、IL-10，以及小肠黏膜保护因子三叶因子3、前列腺素E2和EGF的含量。
5．实时荧光定量PCR实验：取冻存于液氮中的小鼠小肠组织，提取组织总RNA后，采用Promega公司互补DNA(
